Um sensor bioluminescente desenvolvido na UFSCar, a partir da luciferase de um vagalume descoberto no Campus Sorocaba, foi utilizado pela primeira vez para monitorar, em tempo real, alterações de pH no interior de células de câncer colorretal cultivadas em laboratório. Os resultados foram publicados na revista Analytical Chemistry.
A ferramenta, denominada AmyLuc, é uma versão modificada da luciferase de Amydetes vivianii, enzima responsável pela emissão de luz do inseto. Tanto a molécula quanto o vetor que permite sua produção em células de mamíferos foram desenvolvidos no Laboratório de Bioquímica e Tecnologias de Sistemas Bioluminescentes da UFSCar, coordenado por Vadim Viviani, docente do Departamento de Física, Química e Matemática (DFQM-So) do Campus Sorocaba.
A aplicação agora descrita foi conduzida pela pesquisadora Vanessa Bevilaqua durante seu pós-doutorado, no Laboratório de Biomateriais, coordenado por Eliana Duek, docente da Pontifícia Universidade Católica de São Paulo (PUC-SP), Campus Sorocaba, em colaboração com o Laboratório de Bioquímica e Tecnologias de Sistemas Bioluminescentes da UFSCar e o grupo de Cristiana Caliceti, docente da Universidade de Bologna, na Itália.
Estudos anteriores do grupo da UFSCar já haviam caracterizado a AmyLuc e demonstrado seu potencial como indicador de pH. Isso ocorre porque a cor da luz produzida pela enzima varia conforme a acidez do meio. “O passo dado no trabalho publicado agora foi levar essa propriedade para dentro de células vivas. Tratamos da aplicação da AmyLuc em um novo contexto biológico”, esclarece Bevilaqua.
Segundo a pesquisadora, o interesse pelo pH das células tumorais tem uma razão metabólica. “Essas células apresentam um metabolismo bastante adaptado às suas necessidades de crescimento e, em muitas situações, utilizam intensamente a glicólise para produzir energia, gerando também lactato e contribuindo para a acidificação do ambiente celular e extracelular. Esse fenômeno está relacionado ao chamado efeito Warburg”, explica. Assim, medir essas variações enquanto elas acontecem é um dos caminhos para entender como o metabolismo tumoral se reorganiza.
Da cor da luz à medida de pH
O princípio do sensor é simples: a AmyLuc muda de cor conforme o pH do ambiente. Em condições mais ácidas, a luz tende ao vermelho; em condições mais alcalinas, ao verde. Como as próprias células produzem a enzima, a luz emitida por elas permite medir alterações no pH em seu interior.
A escolha da AmyLuc está relacionada ao comportamento da enzima à temperatura das células de mamíferos, de cerca de 37 °C. “Muitas luciferases de vagalumes ficam mais avermelhadas quando a temperatura sobe, o que dificulta distinguir as cores. A AmyLuc mantém a emissão mais próxima do verde nessa temperatura, preservando a diferença necessária para medir o pH”, detalha a pesquisadora.
Nos testes, foram utilizadas células Caco-2, linhagem derivada de um tumor de intestino e usada em laboratório como modelo de câncer colorretal, geneticamente modificadas para produzir a AmyLuc. Inicialmente, os pesquisadores mediram a cor da luz emitida pela enzima purificada em diferentes valores de pH, estabelecendo uma escala de referência. Depois, aplicaram o método às células vivas e acompanharam as mudanças na proporção entre as duas cores ao longo do tempo.
Para testar o sensor em uma situação de estresse, os pesquisadores interferiram de propósito no funcionamento das mitocôndrias, estruturas responsáveis por boa parte da energia da célula. O interior das células acidificou, chegando a pH próximo de 6,3. “Isso mostra como o pH pode funcionar como uma espécie de ‘janela’ para acompanhar o estado metabólico da célula”, resume a pesquisadora.
A AmyLuc é um instrumento de investigação, e não um exame ou um tratamento. Todo o trabalho é feito em células cultivadas em laboratório, e a enzima não é aplicada em pessoas nem em animais. A ideia é observar como as células tumorais reagem a alterações do metabolismo e, mais adiante, a intervenções farmacológicas.
A abordagem apresenta vantagens em relação a métodos já consolidados. A fluorescência, técnica hoje amplamente usada para observar processos dentro de células, exige iluminar a amostra para que o marcador emita luz. Essa iluminação gera um brilho de fundo que atrapalha a leitura e desgasta as células ao longo do experimento. Na bioluminescência, caso da AmyLuc, a própria enzima produz a luz. O método também é menos sensível a variações experimentais. “Em vez de analisar apenas um ponto final, podemos obter uma espécie de ‘filme’ da resposta do pH celular ao longo do experimento”, afirma Bevilaqua.
Entre os próximos passos, o grupo pretende construir vetores que permitam às células produzir o sensor de maneira contínua, o que abriria caminho para estudos de longo prazo, e ampliar a aplicação da ferramenta a outros modelos celulares e condições fisiológicas e patológicas.
Além da UFSCar, o estudo contou com a colaboração de pesquisadores da Universidade de Bologna, na Itália, e da PUC-SP. A pesquisa teve apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fondazione Cassa di Risparmio di Bologna, da Itália.
Os resultados foram publicados no artigo “A Color-Tuning Bioluminescent Sensor (AmyLuc) for Real-Time Monitoring of Intracellular pH Dynamics in Cancer Cells“, na Analytical Chemistry, que pode ser acessado neste link, onde também estão disponíveis as informações completas sobre todos os autores.
